Исследование механизма действия одного из основных ферментов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) – интегразы и структуры комплекса интегразы с ДНК
На основании детального кинетического исследования ферментативных реакций впервые показано, что интеграза ВИЧ-1 является практически однооборотным ферментом. Изучена стехиометрия белково-нуклеинового связывания и с помощью набора модифицированных аналогов вирусной ДНК установлено, какие участки ДНК непосредственно взаимодействуют с определенными остатками лизина в белке. С использованием методов “кросслинкинга” белка и ДНК и криоэлектронной микроскопии исследована структура комплекса интегразы с ДНК и ее клеточным кофактором – белком LEDGF/p75. В сотрудничестве с лабораториями биотехнологии и прикладной генетической фармакологии НЦНИ в г. Кашане и институтом генетики и молекулярной биологии в г. Страгбурге во Франции предложена принципиально новая модель взаимодействия интегразы с вирусной ДНК.
Впервые проведено систематическое исследования ферментативных свойств и лекарственной устойчивости вариантов консенсусной интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A и нового генетического варианта ВИЧ-1 CRF63_02A1, широко распространенных на территории России. Изучено влияние мутаций, вызывающих устойчивость вируса к терапевтическим препаратам - ингибиторам интеграции, на активность этих интеграз.
Впервые проведено систематическое исследования ферментативных свойств и лекарственной устойчивости вариантов консенсусной интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A и нового генетического варианта ВИЧ-1 CRF63_02A1, широко распространенных на территории России. Изучено влияние мутаций, вызывающих устойчивость вируса к терапевтическим препаратам - ингибиторам интеграции, на активность этих интеграз.
Разработка подходов к созданию ингибиторов интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1
Информация, полученная при изучении структуры интегразы ВИЧ-1, использована для разработки новых ингибиторов интеграции на основе соединений различной природы, в том числе на основе коротких модифицированных олигонуклеотидов. Показано, что они являются аллостерическими ингибиторами интегразы: взаимодействуют с комплексом интегразы с вирусной ДНК и вызывают его быструю и эффективную диссоциацию. С использованием суперкомпьютеров Ломоносов и Ломоносов-2 проведено моделирование связывания наиболее эффективного олигонуклеотидного ингибитора с интегразой. Показано, что некоторые олигонуклеотидные ингибиторы интегразы ВИЧ-1 способны подавлять обратную транскрипцию в инфицированных клетках. Обнаружено также несколько новых классов низкомолекулярных органических соединений, обладающих антиинтегразной активностью.
Изучение роли клеточных белков в репликации ВИЧ-1, в частности исследование влияния белков Ku и SFPQ на процессы пост-интеграционной репарации и транскрипции
Это направление работы крайне актуально как для детального понимания развития этого опасного вируса, так и для разработки новых подходов к борьбе с ним. Основное внимание сосредоточено на изучении участия двух белков – Ku70 и SFPQ- в ранних стадиях репликативного цикла ВИЧ-1: обратной транскрипции, интеграции, пост-интеграционной репарации и транскрипции. Разработаны репортерные системы, позволяющие оценивать влияние указанных белков только на одну стадию репликативного цикла ВИЧ-1. Анализируется взаимодействие белков Ku70 и SFPQ с вирусными ферментами: интегразой и обратной транскриптазой.
Впервые показано, что в пост-интеграционной репарации клеточной ДНК участвует ДНК-зависимая протеин-киназа (ДНК-ПК), которая является основным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК по пути негомологичного соединения концов. ДНК-ПК состоит из белка Ku, который является сенсором свободного конца ДНК, и каталитической субъединицы (DNA-PKcs). Установлено, что белок Ku способен связываться с интегразой ВИЧ-1, и выявлены аминокислоты в составе интегразы, необходимые для связывания с Ku. С использованием псевдовируса, содержащего мутантную интегразу, неспособную связывать Ku, показано, что пост-интеграционная репарация начинается с привлечения белка Ku к месту интеграции именно за счет его связывания с вирусной интегразой. Далее сформированная ДНК-ПК фосфорилирует белки, непосредственно осуществляющие процесс репарации. Таким образом, комплекс интегразы и Kuможет рассматриваться как новая потенциальная мишень для анти-ВИЧ препаратов.
Впервые показано, что в пост-интеграционной репарации клеточной ДНК участвует ДНК-зависимая протеин-киназа (ДНК-ПК), которая является основным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК по пути негомологичного соединения концов. ДНК-ПК состоит из белка Ku, который является сенсором свободного конца ДНК, и каталитической субъединицы (DNA-PKcs). Установлено, что белок Ku способен связываться с интегразой ВИЧ-1, и выявлены аминокислоты в составе интегразы, необходимые для связывания с Ku. С использованием псевдовируса, содержащего мутантную интегразу, неспособную связывать Ku, показано, что пост-интеграционная репарация начинается с привлечения белка Ku к месту интеграции именно за счет его связывания с вирусной интегразой. Далее сформированная ДНК-ПК фосфорилирует белки, непосредственно осуществляющие процесс репарации. Таким образом, комплекс интегразы и Kuможет рассматриваться как новая потенциальная мишень для анти-ВИЧ препаратов.
Характеристика взаимодействия белка Ku с нуклеиновыми кислотами
Белок Ku содержит две субъединицы, Ku70 и Ku80, и является важным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК, где он связывается с концами ДНК. Помимо репарации он участвует и в других клеточных процессах, где также может связывать нуклеиновые кислоты. С целью характеристики влияния Ku на транскрипцию изучается взаимодействие Ku с внутренними областями ДНК. Разрабатываются также подходы к созданию ингибиторов связывания Ku с ДНК, что представляет интерес для терапии онкологических заболеваний. Показано также, что белок Ku способен связываться с определенными структурами РНК. В частности, он взаимодействует с TAR РНК, которая играет важную роль во многих этапах развития ВИЧ-1, и 7SKРНК, регулирующей транскрипцию многих генов, осуществляемую РНК-полимеразой II.
Исследование механизма действия одного из основных ферментов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) – интегразы и структуры комплекса интегразы с ДНК
На основании детального кинетического исследования ферментативных реакций впервые показано, что интеграза ВИЧ-1 является практически однооборотным ферментом. Изучена стехиометрия белково-нуклеинового связывания и с помощью набора модифицированных аналогов вирусной ДНК установлено, какие участки ДНК непосредственно взаимодействуют с определенными остатками лизина в белке. С использованием методов “кросслинкинга” белка и ДНК и криоэлектронной микроскопии исследована структура комплекса интегразы с ДНК и ее клеточным кофактором – белком LEDGF/p75. В сотрудничестве с лабораториями биотехнологии и прикладной генетической фармакологии НЦНИ в г. Кашане и институтом генетики и молекулярной биологии в г. Страгбурге во Франции предложена принципиально новая модель взаимодействия интегразы с вирусной ДНК.
Впервые проведено систематическое исследования ферментативных свойств и лекарственной устойчивости вариантов консенсусной интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A и нового генетического варианта ВИЧ-1 CRF63_02A1, широко распространенных на территории России. Изучено влияние мутаций, вызывающих устойчивость вируса к терапевтическим препаратам - ингибиторам интеграции, на активность этих интеграз.
Впервые проведено систематическое исследования ферментативных свойств и лекарственной устойчивости вариантов консенсусной интегразы ВИЧ-1 субтипа А штамма FSU-A и нового генетического варианта ВИЧ-1 CRF63_02A1, широко распространенных на территории России. Изучено влияние мутаций, вызывающих устойчивость вируса к терапевтическим препаратам - ингибиторам интеграции, на активность этих интеграз.
Разработка подходов к созданию ингибиторов интегразы и обратной транскриптазы ВИЧ-1
Информация, полученная при изучении структуры интегразы ВИЧ-1, использована для разработки новых ингибиторов интеграции на основе соединений различной природы, в том числе на основе коротких модифицированных олигонуклеотидов. Показано, что они являются аллостерическими ингибиторами интегразы: взаимодействуют с комплексом интегразы с вирусной ДНК и вызывают его быструю и эффективную диссоциацию. С использованием суперкомпьютеров Ломоносов и Ломоносов-2 проведено моделирование связывания наиболее эффективного олигонуклеотидного ингибитора с интегразой. Показано, что некоторые олигонуклеотидные ингибиторы интегразы ВИЧ-1 способны подавлять обратную транскрипцию в инфицированных клетках. Обнаружено также несколько новых классов низкомолекулярных органических соединений, обладающих антиинтегразной активностью.
Изучение роли клеточных белков в репликации ВИЧ-1, в частности исследование влияния белков Ku и SFPQ на процессы пост-интеграционной репарации и транскрипции
Это направление работы крайне актуально как для детального понимания развития этого опасного вируса, так и для разработки новых подходов к борьбе с ним. Основное внимание сосредоточено на изучении участия двух белков – Ku70 и SFPQ- в ранних стадиях репликативного цикла ВИЧ-1: обратной транскрипции, интеграции, пост-интеграционной репарации и транскрипции. Разработаны репортерные системы, позволяющие оценивать влияние указанных белков только на одну стадию репликативного цикла ВИЧ-1. Анализируется взаимодействие белков Ku70 и SFPQ с вирусными ферментами: интегразой и обратной транскриптазой.
Впервые показано, что в пост-интеграционной репарации клеточной ДНК участвует ДНК-зависимая протеин-киназа (ДНК-ПК), которая является основным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК по пути негомологичного соединения концов. ДНК-ПК состоит из белка Ku, который является сенсором свободного конца ДНК, и каталитической субъединицы (DNA-PKcs). Установлено, что белок Ku способен связываться с интегразой ВИЧ-1, и выявлены аминокислоты в составе интегразы, необходимые для связывания с Ku. С использованием псевдовируса, содержащего мутантную интегразу, неспособную связывать Ku, показано, что пост-интеграционная репарация начинается с привлечения белка Ku к месту интеграции именно за счет его связывания с вирусной интегразой. Далее сформированная ДНК-ПК фосфорилирует белки, непосредственно осуществляющие процесс репарации. Таким образом, комплекс интегразы и Kuможет рассматриваться как новая потенциальная мишень для анти-ВИЧ препаратов.
Впервые показано, что в пост-интеграционной репарации клеточной ДНК участвует ДНК-зависимая протеин-киназа (ДНК-ПК), которая является основным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК по пути негомологичного соединения концов. ДНК-ПК состоит из белка Ku, который является сенсором свободного конца ДНК, и каталитической субъединицы (DNA-PKcs). Установлено, что белок Ku способен связываться с интегразой ВИЧ-1, и выявлены аминокислоты в составе интегразы, необходимые для связывания с Ku. С использованием псевдовируса, содержащего мутантную интегразу, неспособную связывать Ku, показано, что пост-интеграционная репарация начинается с привлечения белка Ku к месту интеграции именно за счет его связывания с вирусной интегразой. Далее сформированная ДНК-ПК фосфорилирует белки, непосредственно осуществляющие процесс репарации. Таким образом, комплекс интегразы и Kuможет рассматриваться как новая потенциальная мишень для анти-ВИЧ препаратов.
Характеристика взаимодействия белка Ku с нуклеиновыми кислотами
Белок Ku содержит две субъединицы, Ku70 и Ku80, и является важным участником системы репарации двуцепочечных разрывов в ДНК, где он связывается с концами ДНК. Помимо репарации он участвует и в других клеточных процессах, где также может связывать нуклеиновые кислоты. С целью характеристики влияния Ku на транскрипцию изучается взаимодействие Ku с внутренними областями ДНК. Разрабатываются также подходы к созданию ингибиторов связывания Ku с ДНК, что представляет интерес для терапии онкологических заболеваний. Показано также, что белок Ku способен связываться с определенными структурами РНК. В частности, он взаимодействует с TAR РНК, которая играет важную роль во многих этапах развития ВИЧ-1, и 7SKРНК, регулирующей транскрипцию многих генов, осуществляемую РНК-полимеразой II.
